Selasa, 03 Mei 2011

Pelaksanaan kultur jaringan


Persiapan
a. Sterilisasi Peralatan
1.      Alat alat gelas (erlenmeyer, botol kultur, gelas ukur, gelas beker, cawan petri, spatula, pipet   tetes, pipet ukur) dicuci dengan deterjen, dibilas dengan air mengalir, dikeringkan
2.      Alat alat diseksi (skalpel, pinset, gunting dan cutter) dicuci dengan deterjen dan dikeringkan dengan kertas
3.      Erlenmeyer diisi air aqua sebanyak 500ml dan diutup dengan aluminium foil lalu dibungkus kertas
4.      Erlenmeyer kosong ditutup dengan aluminium foil
5.      Semua alat tersebut disterilisasi di dalam autoclave pada suhu 121 C dengan tekanan uap 
1,5 atm selama 20 menit
6.      Setelah selesai di sterilisasi semua alat dikeluarkan dari autoclave
b. Sterilisasi alat penabur (Laminar air flow)
1.      Ruang penabur disterilisasi dengan menyemprotkan alcohol 70% dengan menggunakan hand sprayer
2.      Permukaan laminar air flow di basuh menggunakan alcohol 70%
3.      Alat dan bahan  (erlenmeyer, cawan petri, spatula, pipet tetes, pipet ukur, skalpel, pinset, gunting dan cutter, baycline, kapas, betadine, hand sprayer berisi alcohol 70%, lampu bunsen ) diletakkan di Laminar air flow untuk disterilisasi menggunakan lamu UV selama +/- 1 jam
4.      Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang penabur ini digunakan sebelum penanaman eksplan 
 Pembuatan & sterilisasi medium
1.      Labu erlenmeyer ukuran 500 ml diisi dengan 400 ml aqua steril.
2.      Masukkan medium B5 sebanyak 1,3 gr ke dalam erlenmeyer.
3.      Air dalam labu erlenmeyer tersebut kemudian dipindahkan ke dalam 4 erlenmeyer lain dengan ukuran (B5 = 200ml), (1/2 B5 = 100 ml), (1/3 B5 = 50 ml), (1/4 B5 = 50 ml).
4.      Tambahkan air aqua steril pada masing masing perlakuan (B5 = 0ml), (1/2 B5 = 100 ml), (1/3 B5 = 100ml), (1/4 B5 = 150ml).
5.       Masukkan sukrosa dan agar batang pada masing masing perlakuan
6.      Larutan medium a pada labu erlenmeyer  setiap perlakuan dituang ke dalam panci yang dipanaskan diatas kompor gas, kemudian diaduk aduk  menggunakan batang pengaduk.
7.      Apabila larutan  medium telah larut, kemudian dipindahkan ke dalam erlenmeyer
8.      Menambahkan aqua steril sehingga mencapai volume 200ml (kecuali 1/3 B5 sebesar 150 ml)
9.      Mengukur pH medium (5,6 – 5,8), jika terlalu asam ditambahkan NaOH atau KOH dan jika terlalu basa ditambahkan HCL.
10.  Menuangkan medium +/- 20ml ke dalam botol kultur yang telah diberi label.
11.  Menutup botol kultur tersebut dengan plastik tahan panas yang diikat karet kemudian disterilisasi dengan autoklaf.
12.  Setelah selesai disterilisasi, medium tersebut dikeluarkan dan di letakkan di dalam entkas.
13.  Entkas disemprot menggunakan hand sprayer berisi alcohol 70%.
Sterilisasi eksplan
1.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam menggunakan sunlight selama 5 menit lalu dibilas menggunakan air mengalir.
2.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam dalam larutan alcohol 70% selama 20 second kemudian dibilas menggunakan air mengalir
3.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam menggunakan bayclin selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril (dilakukan di dalam laminar air flow)
4.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam dalam larutan betadine selama 5 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 3x (dilakukan di dalam laminar air flow)



Tidak ada komentar:

Posting Komentar