Media MS / Murashige Skoog

Media Murashige & Skoog (MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain, (Erwin, 2009).
Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM.

Adapun kompisisi medium kultur jaringan tanaman adalah sebagai      

berikut:

1) Air

Air merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan karena 95% dari medium mengandung air. Untuk tujuan penelitian, digunakan air destilasi, dan untuk penelitian dengan materi eksplan dari protoplas, meristem dan sel sebaiknya digunakan aquabides (Welsh 1991). Dimana air destilasi (air suling) tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan (Katuuk, 1989).

2) Larutan Garam Anorganik

Tiap tanaman memerlukan setidaknya 6 elemen makronutrien, yaitu unsur yang diperlukan dalam jumlah besar meliputi N, K, Mg, Ca, S, P dan 7 elemen mikronutrien, yaitu unsur yang diperlukan dalam jumlah kecil meliputi Fe, Mn, B, Mo, Cl (Wetherell, 1976). Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH₄NO₃, KNO₃, CaCl_2.2H₂O, MgSO₄.7H₂O dan KH₂PO₄, sedangkan unsur mikro biasanya diberikan dalam bentuk MnSO₄.4H₂O, ZnSO₄.4H₂O, H₃BO₃, KI, Na₂MoO₄.2H₂O₅, CuSO₄.5H₂O dan CoCl₂.6H₂O (Hendaryono dan Wijayani, 1994). 

pereduksi yang berfungsi mereduksi indikator-indikator seperti ion kupri (Cu²⁺) menjadi bentuk kupro (Cu⁺) yang bermanfaat pada perkembangan dan perbaikan (Stryer, 1996).

Vitamin adalah bahan yang perlu ditambahkan dalam medium kultur in vitro, sebab sel bagian tanaman yang dikulturkan secara in vitro belum mampu membuat vitamin sendiri untuk kehidupannya (Katuuk, 1989). Vitamin yang sering ditambahkan ke dalam medium adalah tiamin (vitamin B₁), asam nikotinat (niasin), piridoksin (vitamin B6).

3) Zat-zat organik

Senyawa kimia organik yang biasa dipakai sebagai sumber energi dalam kultur in vitro adalah karbohidrat. Karbohidrat tersusun atas unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama. Bahan-bahan organik yang termasuk karbohidrat meliputi gula, pati dan selulosa. Karbohidrat mempunyai dua fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan dan untuk keseimbangan tekanan osmotik dalam medium. Karbohidrat yang sering digunakan adalah sukrosa meskipun kadang-kadang diganti dengan glukosa (Wetherell, 1982). Menurut Yusnita (2003), glukosa dan fruktosa dapat digunakan tetapi harganya lebih mahal hasilnya tidak selalu lebih baik daripada sukrosa. Konsentrasi sukrosa yang digunakan berkisar 1 – 5% (10 - 15 g/l), tetapi untuk kebanyakan pengkulturan konsentrasi optimum sukrosa adalah 2 - 3%. Sedangkan menurut Wetherell (1982), kadar sukrosa untuk keperluan pengkulturan berkisar antara 2 - 4%. Menurut Suryowinoto (1996), kadar sukrosa yang digunakan sebagai sumber energi untuk menginduksi pertumbuhan eksplan dalam medium adalah 2 - 7%. Katuuk (1989), menyatakan bahwa sukrosa bersifat labil terhadap suhu tinggi sehingga apabila disterilkan dalam autoklaf bersama-sama zat lain akan mengakibatkan penguraian sukrosa menjadi kombinasi antara sukrosa, D-glukosa, dan D-fruktosa. Keuntungan dari penguraian ini adalah terbentuknya aldosa (D-glukosa) dan ketosa (D-fruktosa) yang melimpah ruah.

Tahapan Perbanyakan Tanaman Secara Kultur Jaringan

	Pembuatan Media

Hampir dapat di pastikan bahwa kesuksesan kegiatan kultur jaringan akan sangat di tentukan dan tergantung oleh pilihan media yang di gunakan. Namun pada awalnya media kultur jaringan komposisinya di dasarkan pada bahan-bahan yang di gunakan untuk hidroponik yang berkembang sebelumnya. Unsur- unsur hara di berikan dalam bentuk garam-garam anorganik, namun pada perkembangan selanjutnya para peneliti mulai menambahkan vitamin, senyawa komplek, dan dengan di temukannya zat pengatur tumbu maka zat ini juga mulai di tambahkan. Agar eksplan dapat tumbuh dengan baik maka media kultur jaringan tanaman tidak hanya menyediakan unsur hara-unsur hara makro dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang pada umumnya berupa gula untuk menggantikan karbon yang biasanya di dapat dari atmospere melalui fotosintetis (Gunawan, L.W., 1987; Santoso, U., 2001)
Berbagai komposisi media kultur telah di formulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Contohnya, komposisi Knudson (1946), Heller (1953), Nitsch dan Nitsch (1972), Gamborg dkk. B5 (1976), Linsmaier dan Skoog-LS (1965), Murashige dan Skoog-MS (1962), serta Woody Plant Medium-WPM (Lloyd dan McCown, 1980). Media kultur tersebut, fisiknya dapat berbentuk cair atau padat. Media berbentuk padat menggunakan pemadat media, seperti agar-agar atau gelrite. Komponen media kultur yang lengkap yaitu : air destilata (aquadest) atau bebas ion sebagai pelarut, hara-hara makro dan mikro, gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi, vitamin, asam amino dan bahan organik lain, zat pengatur tumbuh (ZPT), arang aktif, suplemen berupa bahan-bahan alami bila diperlukan, agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media (Yusnita, 2004). 

                  Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan

  Tanaman induk sumber eksplan harus berasal dari tanaman yang jelas jenis, spesies dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman induk sumber eksplan kemudian dikondisikan di rumah kaca atau rumah plastik dengan lingkungan yang higienis untuk mendapatkan eksplan yang berkualitas dan lebih bersih. Pemeliharaan tanaman induk sumber eksplan meliputi pemangkasan, pemupukan dan penyemprotan dengan pestisida (fungsisida, bakterisida, dan insektisida) sehingga tunas yang baru tumbuh menjadi lebih sehat dan bersih dari kontaminan (Yusnita, 2004)

Sterilisasi dan Inisiasi Kultur

                 Inisiasi kultur bertujuan untuk mengusahakan kultur yang aseptik dan aksenik. Eksplan harus disterilisasi untuk mendapatkan kultur yang bersih dari kontaminasi. Bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah jaringan muda yang sedang tumbuh aktif. Jaringan tanaman yang masih muda mempunyai daya regenerasi lebih tinggi, sel-selnya masih aktif membelah diri, dan relatif lebih bersih (mengandung lebih sedikit kontaminan). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan yaitu biji, tunas pucuk, potongan akar, potongan daun, potongan umbi batang, umbi akar, empulur batang, umbi lapis dengan sebagian batang dan bagian bunga. Eksplan merupakan sumber kontaminasi kultur, disamping komponen media, faktor manusia dan lingkungan. Oleh karena itu sebelum ditanam secara aseptik dalam media steril, eksplan harus dibersihkan dari debu, cendawan dan bakteri atau kontaminan dari bagian permukaan eksplan. inisiasi kultur sering terjadi masalah yaitu terjadinya pencoklatan (browning) atau penghitaman bagian eksplan. Pada waktu jaringan tanaman terkena stres mekanik, seperti pelukaan pada proses isolasi eksplan dari tanaman induk atau proses sterilisasi eksplan, metabolisme senyawa berfenol pada eksplan seringterangsang.

Multiplikasi

                 Multiplikasi atau perbanyakan propagul bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio, serta memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktu-waktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya. Pada tahap ini perbanyakan tunas dirangsang, umumnya untuk mendorong percabangan tunas lateral atau merangsang pembentukan tunas adventif. Kondisi ini memerlukan sitokinin seperti BA, BAP, kinetin atau thidiazuron (Yusnita, 2004).

Pemanjangan Tunas, Induksi dan Perkembangan Akar
                 Tunas-tunas yang dihasilkan pada tahap multiplikasi dipindahkan ke media lain untuk pemanjangan tunas. Media untuk pemanjangan tunas mengandung sitokinin sangat rendah atau tanpa sitokinin. Tunas tersebut dapat dipindahkan secara individu atau berkelompok. Pemanjangan tunas secara berkelompok lebih ekonomis daripada secara individu. Setelah tumbuh cukup panjang, tunas tersebut dapat diakarkan. Pemanjangan tunas dan pengakarannya dapat dilakukan sekaligus atau secara bertahap, yaitu setelah dipanjangkan baru diakarkan. Pengakaran tunas in- vitro dapat dilakukan dengan memindahkan tunas ke media pengakaran yang umumnya memerlukan auksin seperti NAA atau IBA.(Yusnita,2004).

Aklimatisasi
                 Herawan dan Hendrati (1996) dalam Waringin (2004) menyatakan bahwa aklimatisasi merupakan salah satu penyesuaian tanaman hasil kultur jaringan tanaman untuk menghadapi kondisi yang lebih sulit terutama menghadapi perpindahan dan media agar ke media tanah, supaya di hasilkan tanaman yang mempunyai akar yang lebih baik dan kokoh sedangkan Yusnita (2004) berpendapat bahwa Aklimatisasi adalah pengkondisian planlet atau tunas mikro di lingkungan baru yang aseptik di luar botol dengan media tanah atau pakis sehingga planlet dapat bertahan dan terus tumbuh menjadi bibit yang siap ditanam di lapang. Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan yang tinggi. Aklimatisasi merupakan tahap kritis karena kondisi iklim mikro di rumah kaca, rumah plastik, rumah bibit dan lapangan sangat jauh berbeda dengan kondisi iklim mikro di dalam botol. Kondisi di luar botol berkelembaban nisbi jauh lebih rendah, tidak aseptik dan tingkat intensitas cahayanya jauh lebih tinggi daripada kondisi di dalam botol.

2,4-Diklorofenoksiasetat) / 2,4 D

                 Menurut Ariwahono, (2010) 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) adalah herbisida sistemik yang umum untuk digunakan dalam mengontrol gulma yang tumbuh dalam tanaman pertanian. Selain itu, 2,4-D dikenal sebagai salah satu jenis auksin sintetik. 2,4-D merupakan jenis auksin sintetis yang sering digunakan dalam kultur jaringan, (Abidin, 1982). Dalam konsentrasi rendah 2,4-D dapat berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh yang mampu merangsang dan menggiatkan pertumbuhan tanaman. Hal serupa juga diungkapkan oleh Fitrianti, (2006) Asam 2,4-D adalah salah satu auksin yang berperan dalam pertumbuhan kalus dari eksplan dan menghambat regenerasi pucuk tanaman. 2,4 Dmemiliki Rantai yang mempunyai gugus karboksil dipisahkan oleh karbon atau karbon dan oksigen akan memberikan aktivitas yang optimal (Abidin, 1985).
Sebagai salah satu senyawa yang masuk ke dalam grup hormon auksin, maka 2,4-D dapat bekerja maksimum untuk pembelahan dan pembesaran sel serta pembentukan akar stek bila diberikan dalam konsentrasi rendah. Herbisida jenis 2,4 -D ini tergolong ideal, karena memiliki beberapa kelebihan diantaranya : relatif murah, tidak meninggalkan racun pada hewan, (Manurung, 2010).

Auksin

Zat pengatur tumbuh pada tanaman (plant regulator) adalah senyawa organik bukan hara (nutrient), yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung (promote), manghambat (inhibit), dan dapat merubah fisiologi tumbuhan (Abidin, 1994). Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya. Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkiraan percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya dibarengi percobaan untuk mengetahui kompisisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuan eksplan yang diinginkan,(Erwin,2009).

                 Menurut Hendaryono, (1994) dan Fitrianti, (2006) dalam kultur in vitro terdapat 2 golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. ZPT ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ. Interaksi dan perimbangan dalam zat pengatur tumbuh (ZPT) yang diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah suatu kultur. Auksin sintetik terdiri dari IAA, IBA, NAA dan herbisida yang bersifat auksin.
Sandra, (2010). Menyatakan bahwa peranan Auksin dalam aktifitas kultur jaringan sangat dikenal sebagai hormon yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam kalus, mendorong proses morfogenesis kalus, membentuk akar atau tunas, mendorong proses embriogenesis, dan auksin juga dapat mempengaruhi kestabilan genetik sel tanaman.
                 Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang pertumbuhan kalus, suspensi sel, dan organogenesis. Pemilihan jenis auksin dan konsentrasinya tergantung dari tipe pertumbuhan yang dikehendaki, level auksin endogen, kemampuan auksin mensintesis auksin dan zat pengatur tumbuh lain yang ditambahkan, (Sandra, 2010).
Santoso dan Nursandi, (2001) menambahkan auksin sebagai zat pengatur tumbuh berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman yaitu :

• Auksin mempengaruhi protein membran sehingga sintesis protein dan asam nukleat dapat lebih cepat

• Auksin dapat mempengaruhi pembentukan akar baru, pembelahan sel dan pembentukantunas, Auksin alamiah yang sering terdapat pada tumbuhan adalah IAA (Asam 3-indol Asetat). IAA disintesis dari triptopan pada bagian tanaman tertentu yaitu primordial daun, daun muda dan biji yang sedang berkembang. Sedangkan auksin sintetik yang sering digunakan dalam kultur jaringan adalah IBA (Asam – Indol Butirat) dan 2,4 D (2,4Diklorofenoksiasetat).

Pelaksanaan kultur jaringan

Persiapan

a. Sterilisasi Peralatan

1.      Alat alat gelas (erlenmeyer, botol kultur, gelas ukur, gelas beker, cawan petri, spatula, pipet   tetes, pipet ukur) dicuci dengan deterjen, dibilas dengan air mengalir, dikeringkan

2.      Alat alat diseksi (skalpel, pinset, gunting dan cutter) dicuci dengan deterjen dan dikeringkan dengan kertas

3.      Erlenmeyer diisi air aqua sebanyak 500ml dan diutup dengan aluminium foil lalu dibungkus kertas

4.      Erlenmeyer kosong ditutup dengan aluminium foil

5.      Semua alat tersebut disterilisasi di dalam autoclave pada suhu 121 C dengan tekanan uap 

1,5 atm selama 20 menit

6.      Setelah selesai di sterilisasi semua alat dikeluarkan dari autoclave

b. Sterilisasi alat penabur (Laminar air flow)

1.      Ruang penabur disterilisasi dengan menyemprotkan alcohol 70% dengan menggunakan hand sprayer

2.      Permukaan laminar air flow di basuh menggunakan alcohol 70%

3.      Alat dan bahan  (erlenmeyer, cawan petri, spatula, pipet tetes, pipet ukur, skalpel, pinset, gunting dan cutter, baycline, kapas, betadine, hand sprayer berisi alcohol 70%, lampu bunsen ) diletakkan di Laminar air flow untuk disterilisasi menggunakan lamu UV selama +/- 1 jam

4.      Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang penabur ini digunakan sebelum penanaman eksplan 

 Pembuatan & sterilisasi medium

1.      Labu erlenmeyer ukuran 500 ml diisi dengan 400 ml aqua steril.

2.      Masukkan medium B5 sebanyak 1,3 gr ke dalam erlenmeyer.

3.      Air dalam labu erlenmeyer tersebut kemudian dipindahkan ke dalam 4 erlenmeyer lain dengan ukuran (B5 = 200ml), (1/2 B5 = 100 ml), (1/3 B5 = 50 ml), (1/4 B5 = 50 ml).

4.      Tambahkan air aqua steril pada masing masing perlakuan (B5 = 0ml), (1/2 B5 = 100 ml), (1/3 B5 = 100ml), (1/4 B5 = 150ml).

5.       Masukkan sukrosa dan agar batang pada masing masing perlakuan

6.      Larutan medium a pada labu erlenmeyer  setiap perlakuan dituang ke dalam panci yang dipanaskan diatas kompor gas, kemudian diaduk aduk  menggunakan batang pengaduk.

7.      Apabila larutan  medium telah larut, kemudian dipindahkan ke dalam erlenmeyer

8.      Menambahkan aqua steril sehingga mencapai volume 200ml (kecuali 1/3 B5 sebesar 150 ml)

9.      Mengukur pH medium (5,6 – 5,8), jika terlalu asam ditambahkan NaOH atau KOH dan jika terlalu basa ditambahkan HCL.

10.  Menuangkan medium +/- 20ml ke dalam botol kultur yang telah diberi label.

11.  Menutup botol kultur tersebut dengan plastik tahan panas yang diikat karet kemudian disterilisasi dengan autoklaf.

12.  Setelah selesai disterilisasi, medium tersebut dikeluarkan dan di letakkan di dalam entkas.

13.  Entkas disemprot menggunakan hand sprayer berisi alcohol 70%.

Sterilisasi eksplan

1.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam menggunakan sunlight selama 5 menit lalu dibilas menggunakan air mengalir.

2.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam dalam larutan alcohol 70% selama 20 second kemudian dibilas menggunakan air mengalir

3.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam menggunakan bayclin selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril (dilakukan di dalam laminar air flow)

4.      Eksplan Centella asiatica (L) Urban direndam dalam larutan betadine selama 5 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 3x (dilakukan di dalam laminar air flow)

Media Kultur Jaringan

  Medium kultur jaringan harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan, yaitu : garam garam mineral sumber unsur unsur makro (C, H, O, N, P, K, S Ca, Mg), garam garam mineral sumber unsur mikro (Cl, Mn, Fe, Cu, Zn, B, Mo), gula sebagai sumber energi, mio inositol, vitamin, dan zat pengatur tumbuh.
  Medium tersebut dapat berupa larutan (cair) dan dapat pula berupa padatan. Medium cair berarti campuran zat zat kimia dengan air suling (aquadest), sedangkan medium padat adalah medium cair ditambah dengan agar sebagai zat pemadat.

Zat Pengatur Tumbuh

            Pemberian zat pengatur tumbuh juga sangat menentukan keberhasilan budidaya secara kultur jaringan. Dalam medium kultur jaringan komponen zat pengatur tumbuh sangat berperan penting dalam proses pertumbuhan, diferensiasi dan organogenesis. Organogenesis adalah proses terbentuknya organ tunas dan akar.

            Dikenal lima golongan zat pengatur tumbuh tanaman antara lain ; auksin, sitokinin, giberelin, asam absisat dan etilen. Dari kelima zat pengatur tumbuh tanaman itu memberi pengaruh yang berbeda dalam proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman, yaitu ; berpengaruh menghambat pertumbuhan dan berpengaruh merangsang pertumbuhan (Barden, 1987).